Revista Lubes em Foco edição 95
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Autores:
Eng. Quím. Emerson Leite – Laboratórios Universal Ind e Com Ltda,
Eng. Quím. Leonard Giordanni Batista – Lab. Universal Ind Com Ltda,
Dr. Tiago Palladino Delforno – ISI – Biotecnologia,
Drª Isabel Teresa Santos Correa – ISI – Biotecnologia,
Drª Angie Alejandra Calderon Fajardo – ISI – Biotecnologia,
Drª Erica Janaina Rodrigues de Almeida – ISI – Biotecnologia,
B.Sc. Carolina Dos Santos Silva – ISI – Biotecnologia
Introdução
Nas últimas décadas, mudanças climáticas geraram uma preocupação com combustíveis fósseis, com destaque para o diesel. Por isso, o desenvolvimento de alternativas renováveis é estimulado. Dentre as matrizes mais utilizadas, o biodiesel de base metílica tem sido mais utilizado devido ao binômio custo x produtividade.
O biodiesel consiste em ésteres mono alquílicos de ácidos graxos de cadeia longa, formados numa reação derivada de álcoois e óleos vegetais ou gorduras animais. O processo produtivo do biodiesel resulta em subprodutos que devem ser purificados, mas não são completamente eliminados pelos processos atualmente aplicados. Desta forma, contaminantes como enxofre, metais e a própria umidade presente no diesel e nos tanques de armazenamento levam à formação de resina, goma e borras que impactam o funcionamento da combustão e dos motores, levando a prejuízos com manutenção e tempo.
Desde 2010, a adição de 5% de biodiesel na matriz energética brasileira já sofria com a formação de borras. O aumento da sua proporção no mercado do diesel para 15% atualmente foi acompanhado de um aumento quase proporcional do problema, levando os fabricantes de veículos, máquinas e equipamentos à diesel a questionarem sobre possíveis soluções.
A Laboratórios Universal, indústria de especialidades químicas com quase 50 anos de atividades, acompanhando as necessidades do mercado, buscou através de seus pesquisadores em parcerias com as melhores Universidades e Centros de Pesquisas uma solução que amenizasse ou inibisse os problemas decorrentes. Neste caso, a parceria com o Instituto Senai de Inovação e Biotecnologia buscou avaliar compostos que inibissem a formação de borras biológicas de diesel e biodiesel.
Metodologia
Para os testes, foram coletadas amostras dos tanques de armazenamento da Distribuidora de Combustíveis da Vibra Energia em São José dos Campos-SP e do reservatório de um caminhão da marca Volvo (modelo TD 102FS) de seis cilindros, identificada como graxa preta (Figura 1). Durante a pesquisa, vários compostos foram desenvolvidos e criteriosamente avaliados, chegando ao composto BX-15, que melhor inibiu a atividade biológica e as reações oxidativas em mistura de até 15% de diesel. O BX-15 é uma molécula produzida pela síntese orgânica de esterificação/eterificação do ácido p-hidroxibenzoico.
A fim de avaliar sua eficácia, foi feito o teste de concentração mínima inibitória (MIC), que consiste em diluir os compostos de forma seriada no solvente Dimetilsulfóxido (DMSO) e incubar cada diluição, assim como o composto não diluído, com microrganismos. Para tal, foram utilizadas culturas dos seguintes microrganismos:
A) Escherichia coli 25922;
B) Pseudomonas aeruginosa AT27853;
C) Bacillus megaterium.
Além disso, foram também avaliados os microrganismos presentes nas amostras de consórcios microbianos:
D) Amostra de Borra coletada do reservatório do caminhão marca Volvo Modelo TD 102FS de 6 cilindros.
E) Amostra de biodiesel autóctone (composta por 50% de biodiesel e 50% de meio de cultura Luria-Bertani (LB) convencional);
F) Amostra de biodiesel alóctone (Composta por 50% de biodiesel (74,5 mL), 50% de Meio LB 10% (74,5 mL) e 1 mL de inóculo metanogênico proveniente de abatedouro de aves).
O BX-15 foi testado em diluições de forma seriada em base 2, em concentrações que variaram desde 8% até 0,0037%. Para garantir a qualidade do ensaio, os testes com as amostras A-D contaram com um controle positivo com DMSO 20% e um controle negativo com DMSO 0,1%. Para as amostras E e F, o controle positivo foi feito com DMSO 75% e o controle negativo com uma suspensão de 50% de inóculo microbiano e 50% de meio de cultura. Adicionalmente, foi realizado um controle de toxicidade para todos os testes utilizando DMSO a 0,5%. Cada poço foi então composto por Caldo Nutriente (ou meio LB para ensaios com biodiesel), pelo inóculo microbiano na concentração de 1·106 UFC/mL e pelo BX-15 na sua respectiva concentração. Os ensaios foram feitos em triplicata para as amostras e em duplicata para os controles. Detalhes do preparo de cada ensaio estão comparados na Tabela 1.
Após a incubação por 24 horas, foi feita adição do corante resazurina, que indica viabilidade dos microrganismos através da mudança de cor para rosa, enquanto o azul indica a ausência de crescimento microbiano, representando a atividade antimicrobiana do composto. Análises quantitativas foram feitas através de espectrofotometria medindo a densidade óptica (D.O.) a 600nm antes da adição do corante. A D.O. está diretamente relacionada à densidade microbiana resultante do crescimento mesmo sob a ação dos compostos.
Resultados e Discussões
Um resumo dos resultados gerados pelos testes de concentração mínima inibitória (MIC) está descrito na Tabela 2, que resultou de análises qualitativas, por análise visual, e quantitativas, por análise de densidade ótica a 600nm.
Os resultados para as amostras A, B e C estão dispostos, respectivamente, nas Figuras 3, 4 e 5. Em relação à cepa Escherichia coli ATCC 25922, houve atividade significativa contra o composto BX-15 testado nas concentrações de 0,5% a 0,0156%. No entanto, a partir de 0,25% a inibição bacteriana foi notada. Pode-se observar que a partir da concentração de 0,125%, há um aumento significativo na densidade celular, confirmando a concentração inibitória mínima do composto em E. coli sendo 0,25%.
Para Bacillus megaterium, também foi observada atividade contra o composto BX-15 testado nas concentrações de 0,5% a 0,0156%. Neste caso, foram encontrados valores significativos de inibição bacteriana a partir de 0,125%. Considerando quantitativamente a análise da densidade óptica do Bacillus, confirma-se a concentração inibitória mínima do composto sendo 0,125%, já que a partir da concentração de 0,0625% tem-se um crescimento mais acentuado de células.
Nos testes realizados com a cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, observa-se um perfil semelhante a E. coli, apesar do seu crescimento mais acentuado. Na análise visual, as amostras também apresentaram atividade contra o composto BX-15 testado nas concentrações de 0,125% a 0,0156%. Nas condições estudadas e na concentração de células padronizada, Pseudomonas aeruginosa apresentou uma taxa de crescimento bastante elevada em relação às demais. Ainda assim, considerando quantitativamente a análise da densidade óptica, observa-se a concentração inibitória mínima do composto sendo 0,25%.
Já para as amostras contendo comunidades microbianas mistas, a Borra coletada do reservatório do caminhão marca Volvo Modelo TD 102FS (Amostra D) teve seu crescimento inibido com BX-15 em concentração mínima de 0,125%, conforme apresentado na Figura 6. Resultados semelhantes foram vistos para o plaqueamento, na Figura 7.
Já em relação aos ensaios feitos com as amostras de biodiesel, a amostra E, contendo a população microbiana autóctone, ou seja, de microrganismos nativos do biodiesel, foi inibida de forma eficaz pelo BX-15 nas concentrações de 0,125%, 0,25% e 0,5%. No entanto, as concentrações inferiores a 0,125% não foram suficientes para inibir o crescimento microbiano, tornando esta a concentração equivalente ao MIC nesta amostra. Os resultados da amostra E podem ser visualizados na Figura 8, que apresenta a placa dos testes MIC.
Por fim, na amostra F de microbiota alóctone, com o biodiesel inoculado por um lodo de abatedouro de aves, o composto BX-15 mostrou-se eficaz em concentrações a partir de 0,25%, como pode ser observado pela Figura 9.
Conclusões
O BX-15 é um produto lipofílico, hidrofóbico, perfeitamente miscíveis com biodiesel, diesel e suas misturas até 15% de biodiesel. Os resultados gerados pelo estudo indicam que a eficiência do BX-15 varia conforme a composição e características do substrato a ser aplicado. Os testes de concentração mínima inibitória (MIC) revelaram os seguintes resultados para culturas puras:
• 0,25% para Escherichia coli ATCC 25922
• 0,25% para Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
• 0,125% para Bacillus megaterium
Em consórcios microbianos complexos – que melhor representam as condições reais de contaminação em sistemas de combustível – o produto demonstrou eficácia significativa, com CMI variando entre 0,125% e 1%. Este desempenho foi comprovado tanto em amostras de biodiesel quanto em borra de reservatório de caminhão, confirmando sua ação inibitória mesmo nas condições mais desafiadoras de contaminação microbiana mista.
