Revista Lubes em Foco edición 95
Haga clic en la revista y lee, descarga o comparte los artículos:
Autores:
Ingeniero Químico Emerson Leite – Universal Ind. e Com Laboratories Ltd.,
Ingeniero Químico Leonard Giordanni Batista – Universal Ind. Com Laboratories Ltd.,
Dr. Tiago Palladino Delforno – ISI – Biotecnología,
Dra. Isabel Teresa Santos Correa – ISI – Biotecnología,
Dra. Angie Alejandra Calderón Fajardo – ISI – Biotecnología,
Dra. Erica Janaina Rodrigues de Almeida – ISI – Biotecnología,
Licenciatura en Ciencias. Carolina Dos Santos Silva – ISI – Biotecnología
Introducción
En las últimas décadas, el cambio climático ha generado preocupación por los combustibles fósiles, en particular el diésel. Por lo tanto, se fomenta el desarrollo de alternativas renovables. Entre las matrices más utilizadas, el biodiésel de base metílico ha sido el más utilizado debido a su relación coste-productividad.
El biodiésel consiste en ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de cadena larga, formados en una reacción entre alcoholes y aceites vegetales o grasas animales. El proceso de producción de biodiésel genera subproductos que deben purificarse, pero que no se eliminan por completo con los procesos actuales. Por lo tanto, contaminantes como el azufre, los metales y la humedad presente en el diésel y los tanques de almacenamiento provocan la formación de resinas, gomas y lodos que afectan la combustión y el rendimiento del motor, generando costos de mantenimiento y paradas.
Desde 2010, la incorporación de un 5% de biodiésel a la matriz energética brasileña ya ha sufrido la formación de lodos. El aumento de su participación en el mercado del diésel, hasta el 15% actual, ha venido acompañado de un aumento casi proporcional del problema, lo que ha llevado a los fabricantes de vehículos, maquinaria y equipos diésel a cuestionar posibles soluciones. Laboratorios Universal, empresa de productos químicos especializados con casi 50 años de experiencia, ha estado monitoreando las necesidades del mercado y, a través de sus investigadores en colaboración con importantes universidades y centros de investigación, buscó una solución que mitigara o previniera los problemas resultantes. En este caso, la colaboración con el Instituto Senai de Innovación y Biotecnología buscó evaluar compuestos que inhibieran la formación de lodos biológicos a partir de diésel y biodiésel.
Metodología
Para las pruebas, se recogieron muestras de los tanques de almacenamiento de la distribuidora de combustible Vibra Energia en São José dos Campos, São Paulo, y del tanque de un camión Volvo (modelo TD 102FS) de seis cilindros, identificado como grasa negra (Figura 1). Durante la investigación, se desarrollaron y evaluaron cuidadosamente varios compuestos, lo que condujo al descubrimiento del BX-15, el cual inhibió mejor la actividad biológica y las reacciones oxidativas en una mezcla de hasta un 15 % de diésel. El BX-15 es una molécula producida por la síntesis orgánica del ácido p-hidroxibenzoico.
Para evaluar su eficacia, se realizó una prueba de concentración mínima inhibitoria (CMI), que consiste en diluir en serie los compuestos en el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO) e incubar cada dilución, así como el compuesto sin diluir, con microorganismos. Para este fin, se utilizaron cultivos de los siguientes microorganismos:
A) Escherichia coli 25922;
B) Pseudomonas aeruginosa AT27853;
C) Bacillus megaterium.
Además, también se evaluaron los microorganismos presentes en las muestras de consorcios microbianos:
D) Muestra de lodo recolectada del tanque de un camión Volvo TD 102FS de 6 cilindros.
E) Muestra de biodiésel autóctono (compuesta por un 50 % de biodiésel y un 50 % de medio de cultivo Luria-Bertani (LB) convencional);
F) Muestra de biodiésel alóctono (compuesta por un 50 % de biodiésel (74,5 mL), un 50 % de medio LB (74,5 mL) y 1 mL de inóculo metanogénico procedente de un matadero de aves de corral).
El BX-15 se analizó en diluciones seriadas en base 2, en concentraciones que oscilaron entre el 8 % y el 0,0037 %. Para garantizar la calidad del ensayo, las muestras A-D se analizaron con un control positivo de DMSO al 20 % y un control negativo de DMSO al 0,1 %. Para las muestras E y F, el control positivo se realizó con DMSO al 75 % y el control negativo con una suspensión de 50 % de inóculo microbiano y 50 % de medio de cultivo. Además, se realizó un control de toxicidad para todas las pruebas utilizando DMSO al 0,5 %. Cada pocillo consistió en caldo nutritivo (o medio LB para ensayos de biodiésel), inóculo microbiano a una concentración de 1·106 UFC/mL y BX-15 a su respectiva concentración. Los ensayos se realizaron por triplicado para las muestras y por duplicado para los controles. Los detalles de la preparación de cada ensayo se comparan en la Tabla 1.
Tras 24 horas de incubación, se añadió el colorante resazurina. Este colorante indica la viabilidad de los microorganismos al cambiar de color a rosa, mientras que el azul indica la ausencia de crecimiento microbiano, lo que representa la actividad antimicrobiana del compuesto. Se realizaron análisis cuantitativos mediante espectrofotometría, midiendo la densidad óptica (D.O.) a 600 nm antes de la adición del colorante. La D.O. está directamente relacionada con la densidad microbiana resultante del crecimiento, incluso bajo la acción de los compuestos.
Resultados y discusiones
En la Tabla 2 se describe un resumen de los resultados generados por las pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI), resultantes de análisis cualitativos mediante análisis visual y cuantitativos mediante análisis de densidad óptica a 600 nm.
Los resultados de las muestras A, B y C se muestran en las Figuras 3, 4 y 5, respectivamente. En la cepa Escherichia coli ATCC 25922, se observó una actividad significativa frente al compuesto BX-15 en concentraciones que oscilaban entre el 0,5 % y el 0,0156 %. Sin embargo, se observó inhibición bacteriana a concentraciones superiores al 0,25 %. Se observa que, a partir de una concentración del 0,125 %, se observó un aumento significativo de la densidad celular, lo que confirma la concentración mínima inhibitoria del compuesto en E. coli del 0,25 %.
En el caso de Bacillus megaterium, también se observó actividad frente al compuesto BX-15 en concentraciones que oscilaban entre el 0,5 % y el 0,0156 %. En este caso, se observaron valores significativos de inhibición bacteriana a partir del 0,125 %. Al analizar cuantitativamente la densidad óptica de Bacillus, la concentración inhibitoria mínima del compuesto se confirma en el 0,125 %, ya que se observa un crecimiento celular más pronunciado por encima del 0,0625 %.
En pruebas realizadas con la cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, se observó un perfil similar al de E. coli, a pesar de su crecimiento más pronunciado. El análisis visual también mostró actividad contra el compuesto BX-15 en concentraciones que oscilaron entre el 0,125 % y el 0,0156 %. En las condiciones estudiadas y a la concentración celular estandarizada, Pseudomonas aeruginosa mostró una tasa de crecimiento significativamente mayor que las demás cepas. Sin embargo, al analizar cuantitativamente la densidad óptica, la concentración inhibitoria mínima del compuesto se observa en el 0,25 %.
En muestras con comunidades microbianas mixtas, el crecimiento del lodo recogido del tanque de un camión Volvo TD 102FS (Muestra D) se inhibió con BX-15 a una concentración mínima del 0,125 %, como se muestra en la Figura 6. Se observaron resultados similares en el cultivo en placa, como se muestra en la Figura 7.
En cuanto a las pruebas realizadas con muestras de biodiésel, la muestra E, que contiene la población microbiana autóctona (es decir, microorganismos nativos del biodiésel), fue inhibida eficazmente con BX-15 a concentraciones del 0,125 %, 0,25 % y 0,5 %. Sin embargo, concentraciones inferiores al 0,125 % no fueron suficientes para inhibir el crecimiento microbiano, lo que la convierte en la concentración equivalente a la CMI en esta muestra. Los resultados de la muestra E se pueden ver en la Figura 8, que muestra la placa de prueba de CMI. Finalmente, en la muestra F de microbiota alóctona, con biodiésel inoculado con lodos de matadero de aves, el compuesto BX-15 demostró ser efectivo a concentraciones a partir del 0,25%, como se puede observar en la Figura 9.
Conclusiones
BX-15 es un producto lipofílico e hidrofóbico, perfectamente miscible con biodiésel, diésel y sus mezclas hasta un 15 % de biodiésel. Los resultados del estudio indican que la eficacia de BX-15 varía en función de la composición y las características del sustrato aplicado. Las pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI) revelaron los siguientes resultados para cultivos puros:
• 0,25 % para Escherichia coli ATCC 25922
• 0,25 % para Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
• 0,125 % para Bacillus megaterium
En consorcios microbianos complejos, que representan mejor las condiciones reales de contaminación en los sistemas de combustible, el producto demostró una eficacia significativa, con CMI que oscilaron entre el 0,125 % y el 1 %. Este rendimiento se demostró tanto en muestras de biodiésel como en lodos de cisternas de camiones, lo que confirma su acción inhibitoria incluso en las condiciones más adversas de contaminación microbiana mixta.
